《新三国》中刘备是于和伟演的。1999年，参演个人首部电视剧《曹操》，从而正式进入演艺圈。2003年，参演高希希执导的抗战剧《历史的天空》。2004年，在情感剧《搭错车》中饰演苏民生。2009年，在古装剧《三国》中饰演刘备。2011年，搭档主演电视剧《青盲》。2011年，凭借电视剧《幸福在路上》获得南方盛典最佳男演员奖。2012年5月22日，获得MSN星月年度最具价值男演员奖。2014年，主演都市情感剧《下一站婚姻》，并凭借该剧获得第17届华鼎奖当代题材最佳男演员奖。

2015年8月9日，凭借电视剧《下一站婚姻》获得第17届华鼎奖最佳男演员奖。2017年9月16日，凭借电影《我不是潘金莲》获得第31届中国电影金鸡奖最佳男配角。2018年，于和伟凭借《大军师司马懿之军师联盟》获得第24届上海电视节白玉兰奖最佳男配角。2019年9月10日，主演的电视剧《人民的正义》开机；同年，获得第十七届电影表演艺术学会奖。

电视剧《新三国》中于和伟饰演的刘备字玄德，三国时期蜀汉开国皇帝，政治家，史家又称他为先主。刘备少年与公孙瓒拜卢植为师求学，而后参与镇压黄巾起义。与关羽、张飞先后救援过北海孔融、徐州陶谦等。陶谦病亡后将徐州让与刘备。